MPXV PCR Detecção de PCR em tempo real do vírus da varíola de macaco multiplexo liofilizado

PROCEDIMENTO OPERACIONAL

1) Extração de Ácido Nucleico Extraia o DNA de espécimes usando um kit de extração adequado. Recomenda-se que o ácido nucleico seja eluído com cerca de 100 μl de tampão de eluição (TE ou H2O livre de nuclease) na etapa final da extração. O ácido nucleico purificado deve ser usado imediatamente ou armazenado a -20°C.

2) Preparação do Controlo Positivo O controlo positivo pode ser armazenado à temperatura ambiente antes da reidratação por até 12 meses. Deve ser reidratado antes do uso, adicionando 250 μl de tampão TE ou H2O livre de nuclease, vortexado em baixa velocidade por 15-20 segundos e centrifugado em baixa velocidade por 15-20 segundos. Use imediatamente ou armazene a -20°C.

3) Preparação da Mistura de RT-PCR em Tempo Real

A) Abra a embalagem a vácuo e retire as tiras de 8 tubos contendo o reagente. Verifique se o pellet está no fundo do tubo (corte o número de tubos conforme necessário, se necessário). Se os tubos fornecidos não forem compatíveis com o seu instrumento, transfira o pellet do reagente para um tubo ótico compatível com o seu instrumento.

B) Abra os tubos e descarte a(s) tampa(s) (não adequada para máquinas de PCR em tempo real) e prepare a mistura de reação no gelo, conforme abaixo

* Água livre de nuclease pode ser usada como controle negativo.

C) Sele os tubos com tampas óticas ou placa de 96 poços com filme de vedação ótica (não fornecido).

D) Vortexe os tubos em baixa velocidade por 10~15 segundos e centrifuge a 3000 rpm por 20 segundos e coloque-os em um instrumento de PCR em tempo real.

3) Configuração da RT-PCR: Defina o volume da reação como 25μl e o procedimento de amplificação por PCR conforme abaixo. Colete a fluorescência FAM (para o gene N), HEX (para o gene E), ROX (para Orf1ab) e CY5 (para o gene RNase P) a 60°C e selecione NENHUM como referência passiva.
4) Análise e Interpretação dos Resultados Defina a linha de limite de acordo com as instruções do instrumento.

A) Controle de Qualidade:

B) Interpretação dos Resultados da Amostra

Parâmetros Técnicos: