1. Calcule o número desejado de micropozos. Remova os micropozos restantes e coloque-os com dessecante no
saco plástico resselável, sele e armazene a 2-8°C para uso posterior.
2. Adicionar Calibradores e Amostras:
2. 1 Poço em branco: Não adicionar reagentes.
2. 2 Poços de Calibradores: Adicionar 100 µL de Calibradores nos poços de controle designados.
2.3 Poços de teste: Adicionar 100 µL de Diluente de Amostra aos poços de teste, em seguida, adicionar 10 µL de amostra no poço correspondente.
2.4 Agitar suavemente a placa por 20 segundos e, em seguida, cobrir a placa com o selador.
3. Incubar: Incubar a placa a 37°C por 30 minutos.
4. Etapa de Lavagem (Pode ser realizada manualmente ou com lavagem automatizada):
Lavagem manual: Remover cuidadosamente a mistura de incubação descartando a solução em um recipiente de resíduos. Encher cada
poço com 350 µL de tampão de lavagem diluído e agitar suavemente por 20-30 segundos. Descartar completamente a solução de lavagem. Repetir 4
vezes adicionais. Após completar a última etapa de lavagem, bater a placa em papel absorvente para remover o líquido residual.
Lavagem automatizada: O lavador automático de placas deve ser calibrado para garantir uma lavagem eficiente. Encher cada poço com 350 µL de
tampão de lavagem diluído e incubar por 20-30 segundos. Aspirar completamente todos os poços. Repetir 4 vezes adicionais.
5. Conjugado: Adicionar 100 µL de conjugado em cada poço, exceto no Poço em Branco.
6. Incubar: Cobrir os poços e incubar a 37°C por 30 minutos.
7. Etapa de Lavagem: Lavar a placa 5 vezes conforme descrito na etapa 4.
8. Substrato: Adicionar 50 µL de Substrato A e 50 µL de Substrato B em cada poço, incluindo o Poço em Branco. Agitar suavemente os
micropozos por 20 segundos. Incubar a 37°C no escuro por 15 minutos.
9. Solução de Parada: Adicionar 50 µL de Solução de Parada em cada poço. Uma cor amarela deve se desenvolver nos poços contendo espécimes Positivos.
10. Ler Resultados: Ler a 450/630-700 nm em até 30 minutos.
1. Observação: A microplaca também pode ser lida a 450 nm, mas é fortemente recomendado lê-la a 450/630-700 nm para
melhores resultados.
Cronometragem: Ler a densidade óptica (DO) da amostra a 450nm com um leitor de microplacas.
O valor médio de DO do controle negativo ≤ 0,1 e o valor médio de DO do controle positivo ≥ 0,8, o teste é válido,
caso contrário, o teste é inválido.
Valor de Corte (C.O.) = O valor médio de DO do controle negativo x 3 (Calculado por 0,10 quando o valor médio
de DO do controle negativo é< 0,10, calculado pelo valor real quando o valor médio de DO do controle negativo
Resultados Positivos: Valor de DO da amostra ≥ C.O.
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