2.3 Poços de teste: Adicionar 100 µL de Diluente de Amostra aos poços de teste, em seguida, adicionar 10 µL de amostra no poço correspondente.
2.4 Agitar suavemente a placa por 20 segundos e, em seguida, cobrir a placa com o selador.
3. Incubar: Incubar a placa a 37°C por 30 minutos.
4. Etapa de Lavagem (Pode ser realizada manualmente ou com lavagem automatizada):
Lavagem manual: Remover cuidadosamente a mistura de incubação descartando a solução em um recipiente de resíduos. Encher cada poço com 350 µL de tampão de lavagem diluído e agitar suavemente por 20-30 segundos. Descartar completamente a solução de lavagem. Repetir mais 4 vezes. Após completar a última etapa de lavagem, bater a placa em papel absorvente para remover o líquido residual.
Lavagem automatizada: O lavador automático de placas deve ser calibrado para garantir uma lavagem eficiente. Encher cada poço com 350 µL de tampão de lavagem diluído e incubar por 20-30 segundos. Aspirar todos os poços completamente. Repetir mais 4 vezes.
5. Conjugado: Adicionar 100 µL de conjugado em cada poço, exceto no Poço em Branco.
6. Incubar: Cobrir os poços e incubar a 37°C por 30 minutos.
7. Etapa de Lavagem: Lavar a placa 5 vezes conforme descrito na etapa 4.
8. Substrato: Adicionar 50 µL de Substrato A e 50 µL de Substrato B em cada poço, incluindo o Poço em Branco. Agitar suavemente os micropoços por 20 segundos. Incubar a 37°C no escuro por 15 minutos.
9. Solução de Parada: Adicionar 50 µL de Solução de Parada em cada poço. Uma cor amarela deve se desenvolver nos poços contendo espécimes positivos.
10. Ler Resultados: Ler a 450/630-700 nm em até 30 minutos.
1. Nota: A microplaca também pode ser lida a 450 nm, mas é fortemente recomendado lê-la a 450/630-700 nm para melhores resultados.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Cronometria: Ler a densidade óptica (DO) da amostra a 450nm com um leitor de microplacas.
O valor médio do controle negativo de DO ≤ 0,1 e o valor médio do controle positivo de DO ≥ 0,8, o teste é válido, caso contrário, o teste é inválido.
Resultados Positivos: Valor de DO da amostra ≥ C.O.
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